2.4 重复性试验
取同一批中药口服液,马香按供试品溶液制备法平行制备6份。苓口立按色谱条件进样30 μL,服液方法每个样品连续进样2次,中白酯Ⅲ记录色谱图,术内测定峰面积。含量计算结果得相对峰面积RSD=6.00%,测定表明本方法重复性良好。马香
2.5 稳定性试验
取同一批中药口服液(批号:20160721),苓口立按供试品溶液制备法制备,服液方法考察其日内精密度与日间精密度。中白酯Ⅲ分别于0、术内2、含量4、测定8、马香12、16、24 h内及在0、12、24、36、48、60、72 h之内分别精密量取供试液,按照色谱条件进样30 μL,每个样品进样2次,记录色谱图,测定峰面积。计算结果得24 h内平均含量2.27 μg/mL,相对平均含量RSD=8.14%,相对峰面积RSD=6.00%;72 h内平均含量2.20 μg/mL,相对平均含量RSD=9.54%,相对峰面积RSD=8.58%,表明本方法在72 h内重复性、稳定性良好。
2.6 加样回收率试验
精密称取白术内酯Ⅲ 5.98 mg于5 mL容量瓶,加甲醇溶解并定容至刻度,得其浓度为1.196 mg/mL白术内酯Ⅲ对照液,根据前期研究算出供试液含量,特此进行配制高、中、低3个不同标准品浓度作为加样标液,分别取0.6、0.5、0.4 mL于10 mL容量瓶,加甲醇稀释并定容至刻度,得其加样标液浓度分别为71.76、59.8、47.84 μg/mL。
精密量取同批次(批号:20160721)中药口服液置于分液漏斗中,分为9份,每份样品液为25 mL,分为高中低3组,每3份口服液为1组,各分别精密加入1 mL白术内酯Ⅲ对照液于分液漏斗中,混匀,按供试品溶液制备法制备,即得加样回收供试液。按色谱条件进样,每个样品进样2次,记录色谱图,测定峰面积,并计算含量与回收率。其平均回收率为98.04%,RSD=11.89%,表明回收相对较好(表2、表3)。计算公式为:测得加入量=测得总量-中药口服液本身含有量,回收率=测得加入量/实际加入量×100%
2.7 耐用性试验
研究的变动因素主要有:柱温分别为20℃、25℃、30℃,流速0.8 mL/min, 色谱柱为ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm, Agilent Technologies);流速分别为0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min, 柱温25℃,色谱柱为ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm, Agilent Technologies);色谱柱分别为ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm, Agilent Technologies)、PhenomenexGemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)、Vydac 218 TP C18(5 μm×250 mm×4.60 mm, Grace),柱温25℃,流速0.8 mL/min。
按以上变量色谱条件进样,其中白术内酯Ⅲ对照液(73μg/mL)进样10 μL,20160721批供试液进样30 μL,每个样品进样2次,记录色谱图,测定峰面积。当柱温改变,其他条件不变时,相对保留时间RSD=0.44%,相对含量RSD=4.15%;当流速改变,其他条件不变时,相对保留时间RSD=1.25%,相对含量RSD=3.49%;当换用不同型号色谱柱,其他条件不变时,相对保留时间RSD=0.64%,相对含量RSD=8.20%。从相对RSD值来看,不同型号色谱柱对保留时间差异最小,对其含量变化值相对较大;柱温和流速的改变对其保留时间和含量变化差异均较小(表4~表6)。
因此,在测定白术内酯Ⅲ含量时柱温应保持在25℃,流速保持在0.8 mL/min, 选用Phenomenex Gemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)柱子进行测定,其所得含量相对较高、稳定且峰形较好,进样重复性好。
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